현장 혼성화(ISH)를 위한 플라스미드(프로브) 꽁 머니 카지노 분리
- 단일 콜로니의 Kaput 꽁 머니 카지노에 2mL 배양액을 접종하고 밤새 37°C 진탕기에 올려 놓습니다.
- 2mL 전배양물을 플라스크에 부어 1L 플라스크에 400mL 배양물을 접종합니다. 진탕하면서 37°C에서 4~5시간 동안 배양합니다.
- 4°C에서 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 따라내고 남은 액체가 펠릿에서 배수될 수 있도록 얼음 위에 비스듬히 놓습니다.
- 용액 I(50mM 포도당, 25mM Tris pH 8.0, 10mM EDTA) 5mL에 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 배양물을 50mL Nalgene 다알로머 원심분리 꽁 머니 카지노로 옮깁니다.
- 용액 II(O.2 N NaOH, 1 % SDS) 10 mL를 추가하고 꽁 머니 카지노를 Parafilm으로 덮은 다음 부드럽게 반복적으로 뒤집어 혼합합니다. 용액을 얼음 위에 10분 동안 놓아두십시오.
- 용액 III(3 M NaAc pH 4.8) 7.5 mL를 추가하고 꽁 머니 카지노를 파라필름으로 덮은 다음 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
- 꽁 머니 카지노를 4°C에서 15분간 12,000rpm으로 원심분리하고, 상층액을 두 번째 50mL 꽁 머니 카지노에 붓고, 11mL 이소프로판올을 추가하고, 파라필름으로 덮고 원심분리꽁 머니 카지노를 5,000rpm에서 5분간 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 4°C, 상청액을 따라내고 펠릿을 70% 에탄올로 헹구십시오.
- TE에 4.7g의 CcCl 및 0.4mL의 10mg/ml 에티듐 브로마이드 용액을 추가합니다(샘플의 밀도는 1.55~1.59g/mL 사이입니다. TE 또는 CsCl를 추가하여 조정합니다. CsCl 정제가 없는 플라스미드 꽁 머니 카지노도 비오틴 라벨링에 사용할 수 있지만 CsCl 정제 플라스미드 꽁 머니 카지노를 사용하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
- 용액을 Beckman '13 x51' 다알로머 신속 밀봉 꽁 머니 카지노에 옮기고 목 바로 아래까지 채우고(이제 꽁 머니 카지노의 무게는 9.45-9.6g이어야 함) 밀봉합니다.
- 꽁 머니 카지노를 20°C에서 65,000rpm으로 4시간 동안 또는 밤새 55,000rpm으로 원심분리합니다.
- 바늘과 주사기를 사용하여 꽁 머니 카지노에서 플라스미드 밴드를 제거하고 1.5mL 꽁 머니 카지노로 옮깁니다.
- 포화 이소프로판올 1 부피를 추가하고(동량의 이소프로판올과 20 X SSC pH 7.0 혼합) 잘 섞습니다. 원심분리하거나 몇 분 동안 그대로 두십시오.
- 추출을 4~5회 반복하거나 프로판올의 분홍색이 사라질 때까지 반복하십시오.
- 꽁 머니 카지노 샘플을 2배량의 TE로 희석하고 1/10 부피의 3M NaAc pH 7을 추가하고 잘 섞습니다.
- 2배량의 95% 에탄올을 추가하고 잘 섞으세요.
- 5분 동안 원심분리하고, 꽁 머니 카지노를 배출하고, 펠릿과 꽁 머니 카지노 측면을 70% 에탄올로 헹구고, 에탄올을 배출하고, 펠렛을 건조시킵니다.
- 꽁 머니 카지노를 400 µL TE에 녹이고 20 µL RNase A(10 mg/mL)를 추가한 후 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 동량의 1:1 페놀:클로로포름 용액을 추가하고 잘 섞은 후 잠시 원심분리한 후 상부 상을 다른 꽁 머니 카지노로 옮깁니다.
- 동량의 클로로포름을 추가하고 잘 섞은 후 잠시 원심분리한 후 상부 상을 다른 꽁 머니 카지노로 옮깁니다.
- 3M NaAc와 에탄올로 꽁 머니 카지노를 침전시키고 펠렛을 400μL TE에 용해시킵니다.
- 분광광도계를 사용하거나 미니젤에서 전기영동을 통해 꽁 머니 카지노 농도를 측정하세요.
