현장 하이브리드 화를위한 비오틴-표지 카지노 토토 준비 및 정화 (ISH)

제안 된 화학 물질 : Nick Translation Kit, Enzo Diagnostics CAT. No. 42803.

플라스미드 또는 게놈 DNA의 카지노 토토 표지

1. 다음 카지노 토토 화 혼합물 준비.

DNTP (Biotin-11-DUTP 포함	5 µL
플라스미드 또는 게놈 카지노 토토	1 µg
카지노 토토 폴리머 라제 I	5 µL
카지노 토토se I	x µL
Deionized 또는 증류수	y µL
총 반응 부피 (h2o 총 부피를 20 ㎕로 조정하려면	50 µL

1. 반응 튜브를 14-15 ° C에서 2 시간 동안 수조에서 배양합니다.
2. 5 μL 정지 버퍼를 추가하여 반응 중지.

DNA가 깨끗한 경우 라벨링의 가장 중요한 부분은 최종 Nick-Translation 제품의 크기입니다. 비오틴-표지 카지노 토토 크기가 약 300-600 bp 일 때 최상의 ISH 결과가 얻어진다.

비오틴-표지 카지노 토토 정제

1. 닉 전환 인큐베이션이 끝나기 전 20 분, 1ml 투베르큘린 주사기의 바닥에 실리콘 화 된 유리 울을 꽂습니다.
2. 멸균 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 Sephadex G-50으로 주사기를 상단에 채우십시오.
3. Sephadex로 채워진 주사기를 15ml 코어스 튜브에 넣고 1,500 rpm으로 4 분 동안 원심 분리하여 Sephadex를 포장합니다.
4. 포장 된 Sephadex 컬럼의 총 부피가 약 0.9 ml의 총 부피를 가질 때까지 이전 두 단계를 반복합니다.
5. 각각 4 분 동안 1,500 rpm에서 회전하여 55 μL TE로 컬럼을 두 번 씻으십시오.
6. 15ml 코르크스 튜브 하단에 멸균 된 1.5ml 튜브를 놓고 포장 된 주사기를 1.5ml 튜브에 맞출 수있는 방식으로 포장 된 주사기를 코어 렉스 튜브에 삽입합니다. Nick Translation 제품 (정지 버퍼의 55 μl)을로드하고 1,500 rpm에서 4 분 동안 회전하십시오.

최종 카지노 토토 부피는 55 µL에 가깝습니다. 일반적으로, 이러한 비오틴-표지 된 프로브 5 ㎕ (1 µg/55 µL = 18 ng/µL)는 한 슬라이드에 충분하며 프로브를 사용하여 100 슬라이드를 처리 할 수있다.